Principal diferença - PCR vs RT-PCR

PCR e RT-PCR são duas técnicas importantes em biologia molecular. O PCR foi desenvolvido por Kary Mullis na década de 1980. É capaz de aumentar o número de cópias de um determinado gene de forma exponencial, facilitando a detecção daquele determinado fragmento de DNA. A Taq Polimerase é a enzima mais freqüentemente usada em sistemas de PCR. É uma enzima termoestável. Em RT-PCR, a transcrição reversa é seguida por PCR. A enzima, a transcriptase reversa, está envolvida na síntese de DNA complementar a partir de RNA. o principal diferença entre PCR e RT-PCR é que O PCR usa DNA de fita dupla como molde, enquanto o RT-PCR usa RNA como molde.

Principais áreas cobertas

1. O que é PCR - Definição, Processo, Aplicação 2. O que é RT PCR - Definição, características, aplicação 3. Qual é a diferença entre PCR e RT PCR - Comparação das principais diferenças

Termos-chave: PCR, RT-PCR, Reação em Cadeia da Polimerase, Reação em Cadeia da Polimerase-Transcrição Reversa, Molde de DNA, Polimerase de DNA, Desnaturação, Recozimento, Extensão de Primer

O que é PCR

PCR (Reação em cadeia da polimerase) é um método relativamente simples, mas revolucionário. O PCR usa a capacidade da enzima DNA polimerase de sintetizar novas fitas de DNA de maneira complementar à fita modelo oferecida. PCR é uma técnica indispensável usada em laboratórios clínicos e de pesquisa para análise funcional de genes, diagnóstico e monitoramento de doenças hereditárias, clonagem de DNA, sequenciamento e amplificação de DNA antigo. Molde de DNA, nucleotídeos, primers e DNA polimerase são os quatro principais componentes da PCR. o Molde de DNA geralmente é um DNA de fita dupla com a sequência alvo, que deve ser amplificada. Taq DNA polimerase que é isolado de Thermus aquatics é comumente usado em PCR. o Pfu DNA polimerase é outro tipo de DNA polimerase com alta fidelidade. As polimerases Taq e Pfu são resistentes ao calor. Os nucleotídeos adicionados pelas DNA polimerases são adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T). Uma vez que a DNA polimerase só pode adicionar um novo nucleotídeo em uma extremidade 3 'de uma fita de DNA pré-existente, um oligonucleotídeo iniciador é necessário para o início da síntese de DNA. A exigência de um primer na PCR permite delinear apenas uma região específica no molde. A sequência alvo é flanqueada por primers direto e reverso. No final de um PCR, novas cópias chamadas amplicons de uma sequência específica de DNA são acumuladas aos bilhões. Os componentes da PCR devem ser otimizados de forma a melhorar o desempenho da PCR e ao mesmo tempo minimizar a falha.

O PCR é um processo automatizado realizado por termocicladores, que são capazes de alternar entre diferentes temperaturas. O PCR é um processo de três etapas.

1. Desnaturação - O molde de DNA de fita dupla é separado em duas fitas simples por aquecimento a 94-95 ° C.
2. anelamento - Os primers forward e reverse ligam-se às sequências complementares no modelo. A temperatura desta etapa depende da temperatura de fusão da combinação de primer.
3. Extensão de primer - A enzima DNA polimerase estende cada um dos primers em sua extremidade 3 ', adicionando bases complementares à fita em crescimento. A temperatura ótima da Taq polimerase, 72 ° C, é usada como a temperatura na etapa de extensão. O tempo da extensão depende do número de pares de bases na fita do modelo.

As três etapas são repetidas 28-35 vezes.

Figura 1: Reação em cadeia da polimerase

Os produtos da PCR são fracionados por tamanho por eletroforese em gel de agarose em comparação com uma escada de DNA. A visualização do DNA em um gel de agarose é feita pela coloração com brometo de etídio e observação sob UV. As bandas de DNA amplificadas sob UV em um gel corado com brometo de etídio são mostradas na figura 2. A escada de DNA é mostrada no poço mais à esquerda.

Figura 2: bandas de DNA

O que é RT-PCR

RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa) é uma das técnicas mais sensíveis usadas para a detecção de mRNA. O RNA é o modelo apropriado para reunir informações sobre a expressão gênica de um tecido normal ou a expressão gênica de um tecido infectado. O modelo para o RT-PCR pode ser RNA total ou RNA viral ou bacteriano, respectivamente. O RNA é reversamente transcrito em DNA complementar (cDNA) pela enzima, a transcriptase reversa. A temperatura ótima da transcriptase reversa é 46 ° C. O cDNA é utilizado em PCR para a obtenção do produto. As etapas na PCR de transcrição reversa são mostradas na figura 3.

Figura 3: RT-PCR

O RT-PCR pode ser realizado em reações de duas ou uma etapa. Na reação em duas etapas, a transcrição reversa e a PCR são realizadas em duas etapas separadas. No RT-PCR de uma etapa, a transcrição reversa é seguida por PCR em um único tubo de maneira sequencial. Tanto o cDNA quanto o produto final de PCR podem ser executados em um gel de agarose para fins de fracionamento por tamanho e visualização. RT-PCR de uma e duas etapas são mostrados na figura 4.

Figura 4: RT-PCR de uma e duas etapas

Diferença entre PCR e RT-PCR

Definição

PCR: PCR é uma técnica usada em biologia molecular para amplificar um segmento de DNA gerando milhões de cópias de uma sequência de DNA.

RT-PCR: RT-PCR é uma variante da PCR usada na detecção da expressão gênica em biologia molecular.

Passos

PCR: Desnaturação, anelamento e extensão são as três etapas do PCR.

RT-PCR: Em RT-PCR, a transcrição reversa é seguida por PCR.

Modelo

PCR: Uma molécula de DNA de fita dupla serve como molde para a PCR.

RT-PCR: Uma molécula de RNA de fita simples serve como molde para a transcrição reversa. Uma molécula de DNA de fita simples serve como molde para a PCR.

Enzimas Usadas

PCR: A DNA polimerase é usada como enzima na PCR.

RT-PCR: A transcriptase reversa e a DNA polimerase são utilizadas como enzimas em RT-PCR.

Primers

PCR: Primers direto e reverso são usados ​​na PCR.

RT-PCR: Apenas o primer reverso é usado para a transcrição reversa e os primers direto e reverso são usados ​​na PCR.

Sensibilidade

PCR: O PCR é um método sensível.

RT-PCR: O RT-PCR é mais sensível que o PCR.

Formulários

PCR: O PCR é usado na análise funcional de genes, diagnóstico e monitoramento de doenças hereditárias, clonagem de DNA, sequenciamento de DNA e amplificação de DNA antigo.

RT-PCR: O RT-PCR é usado na detecção da expressão gênica.

Conclusão

PCR e RT-PCR são duas das técnicas importantes utilizadas em biologia molecular. Tanto a PCR quanto a RT-PCR são técnicas automatizadas capazes de aumentar exponencialmente o número de cópias de uma sequência de DNA alvo, que é definida pelos primers direto e reverso. Na PCR, o DNA de fita dupla é usado como molde. Por PCR, clonagem de DNA, sequenciamento de DNA e análise funcional dos genes podem ser feitas. Em RT-PCR, a expressão gênica em um determinado tecido pode ser observada pela amplificação do RNA. A principal diferença entre o PCR e o RT-PCR está nos modelos usados ​​em cada reação e em suas aplicações.

Referência:

1. ”Reação em cadeia da polimerase (PCR).” Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia. Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA, n.d. Rede. Disponivel aqui. 01 de junho de 2017. 2. ”Reação em cadeia da polimerase (ou PCR).” Cloning and Molecular Analysis of Genes. N.p., n.d. Rede. Disponivel aqui. 01 de junho de 2017. 3. Biolabs, New England. “Síntese de CDNA e RT-PCR”. Síntese de CDNA e RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Rede. Disponivel aqui. 01 de junho de 2017.

Cortesia de imagem:

1. ”Reação em cadeia da polimerase” Por Enzoklop - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. “DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis.” Por Rainis Venta - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 3. “Reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa” Por Jpark623 - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 4. “One-step vs two-step RT-PCR ”Por Jpark623 - Trabalho do próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia