Principal diferença - PCR vs QPCR

PCR (reação em cadeia da polimerase) e qPCR (PCR quantitativo) são duas técnicas utilizadas em biotecnologia para amplificar DNA para diversos fins. O PCR é uma técnica relativamente simples. qPCR também é conhecido como PCR em tempo real ou PCR digital. o principal diferença entre PCR e qPCR é que PCR é uma técnica qualitativa, enquanto qPCR é uma técnica quantitativa. O PCR permite a leitura do resultado como "presença ou ausência". Já na qPCR, a quantidade de DNA amplificado em cada ciclo é quantificada. Se o RNA é usado em PCR, a técnica é conhecida como RT-PCR (PCR de transcrição reversa), e se o RNA é usado em qPCR, a técnica é conhecida como qRT-PC.

Principais áreas cobertas

1. O que é PCR - Definição, Processos, Usos 2. O que é QPCR - Definição, Processos, Usos 3. Quais são as semelhanças entre PCR e QPCR - Esboço de características comuns 4. Qual é a diferença entre PCR e QPCR - Comparação das principais diferenças

Termos-chave: eletroforese em gel de agarose, amplicons, DNA polimerase, corante fluorescente, PCR, sondas, qPCR, RT-qPCR

O que é PCR

PCR refere-se a uma técnica em biotecnologia que permite a análise de uma sequência curta de DNA por meio da amplificação de um segmento selecionado de DNA. É comparativamente um método sensível, pois volumes muito pequenos são necessários para uma única reação. A técnica é baseada na capacidade da DNA polimerase de sintetizar novas fitas de DNA para a fita modelo oferecida de maneira complementar. A mistura de reação de PCR é composta por DNA polimerase, nucleotídeos de DNA, primers, o molde de DNA a ser amplificado e magnésio. A amplificação é realizada dentro de um termociclador. A DNA polimerase deve ser resistente ao calor, pois altas temperaturas são usadas nesta reação. Os dois tipos de DNA polimerases usados ​​na PCR são Taq DNA polimerase e Pfu DNA polimerase. A Taq DNA polimerase é amplamente utilizada em PCR.

A DNA polimerase requer uma fita de DNA pré-existente na extremidade 3 'para sintetizar uma nova fita. Portanto, um iniciador de oligonucleotídeo é adicionado à mistura de reação para o início da síntese de DNA. A exigência de um primer na PCR permite a amplificação de apenas uma região específica do molde. A sequência alvo é flanqueada por primers direto e reverso. No final de uma PCR, novas cópias de uma sequência de DNA específica, que são chamadas amplicons, são acumulados em bilhões. Os componentes da PCR devem ser otimizados de forma a melhorar o desempenho da PCR e ao mesmo tempo minimizar a falha. A reação de PCR padrão é mostrada na figura 1.

Figura 1: PCR

Etapas de PCR

As três etapas de um PCR são descritas abaixo.

1. Desnaturação - O molde de DNA de fita dupla é separado em duas fitas simples por aquecimento a 94-95 ° C.
2. anelamento - Os primers forward e reverse ligam-se às sequências complementares no modelo. A temperatura depende da temperatura de fusão da combinação de primer.
3. Extensão de primer - A enzima DNA polimerase estende cada iniciador em sua extremidade 3 ', adicionando bases complementares à fita em crescimento. A temperatura ótima da Taq polimerase, isto é, 72 ° C, é usada como a temperatura na etapa de extensão. O tempo da extensão depende do número de pares de bases na fita do modelo.

As três etapas são repetidas 28-35 vezes. A eletroforese em gel de agarose é usada no fracionamento por tamanho de produtos de PCR. O produto é corado por brometo de etídio e é observado sob UV. O produto de PCR ou o DNA amplificado podem ser usados ​​em clonagem, sequenciamento ou genotipagem.

O que é QPCR

QPCR refere-se a uma técnica em biotecnologia que permite a detecção, caracterização e quantificação de ácidos nucleicos para várias aplicações. Portanto, é um tipo de PCR quantitativo. Tanto o DNA quanto o RNA podem ser usados ​​como qPCR. Se o RNA for usado como molde, ele deve ser primeiro transcrito reversamente em cDNA. Assim, este tipo de qPCR é conhecido como RT-qPCR. A PCR tradicional é realizada para cDNA ou amostra de DNA usual. No entanto, em qPCR, os corantes fluorescentes são usados ​​para rotular o produto de PCR em cada etapa do ciclo de PCR. Isso permite a coleta de dados à medida que a PCR avança, permitindo a quantificação dos amplicons durante a fase exponencial da PCR. O principal tipo de corante usado em qPCR é SYBR Green. O corante se liga ao DNA de fita dupla. Como a fluorescência é aumentada proporcionalmente com a quantidade de DNA amplificado, a quantificação pode ser feita em “tempo real”. A principal desvantagem do uso do corante é que ele permite a quantificação de um produto específico na amostra. Além dos corantes, as sondas também podem ser utilizadas no processo de quantificação. As sondas TaqMan são um dos principais tipos de sondas oligonucleotídicas usadas em qPCR, e o processo de emissão de fluorescência é mostrado na figura 2.

Figura 2: Sonda TaqMan

As sondas podem ser projetadas de forma a detectar vários produtos de PCR na mesma amostra. A sonda TaqMan é um dos principais tipos de sondas de hidrólise; a incorporação desta sonda no produto de PCR expõe o fluoróforo, emitindo a fluorescência. Os corantes fluorescentes são mais específicos para o produto de PCR. Portanto, eles são usados ​​na maioria dos ensaios de diagnóstico para detectar o produto de PCR.

Semelhanças entre PCR e QPCR

Diferença entre PCR e QPCR

Definição

PCR: O PCR é uma técnica em biotecnologia que permite a análise de uma sequência curta de DNA por meio da amplificação de um segmento selecionado de DNA.

QPCR: QPCR é uma técnica em biotecnologia que permite a detecção, caracterização e quantificação de ácidos nucléicos para diversas aplicações.

Quantitativo / Qualitativo

PCR: PCR é uma técnica qualitativa.

QPCR: QPCR é uma técnica quantitativa.

Detecção do Produto

PCR: O produto é detectado pela eletroforese em gel de agarose em PCR.

QPCR: O produto pode ser detectado em cada ciclo de amplificação em qPCR.

Coleção de dados

PCR: Os dados são coletados ao final da reação em PCR.

QPCR: Os dados são coletados durante a fase exponencial da reação em qPCR.

Resolução

PCR: O PCR tem uma resolução muito pobre.

QPCR: QPCR tem uma resolução muito alta.

Tinturas

PCR: A PCR usa brometo de etídio para manchar o produto durante a PCR.

QPCR: QPCR usa corantes fluorescentes para detectar o produto.

Tempo

PCR: O PCR é um método mais demorado.

QPCR: QPCR é menos demorado.

RNA

PCR: RT-PCR é o tipo de PCR que usa RNA como molde.

QPCR: RT-qPCR é o tipo de qPCR que usa RNA como modelo.

Função

PCR: O PCR é usado para detectar a presença ou ausência de certos fragmentos genômicos.

QPCR: QPCR é usado para quantificar um fragmento específico em uma amostra.

Conclusão

PCR e qPCR são dois tipos de técnicas usadas em biotecnologia para amplificar DNA para diversos fins. PCR é o método tradicional de amplificação usado para identificar a presença ou ausência de um fragmento de DNA. QPCR é usado para quantificar um fragmento específico em uma amostra. Assim, PCR é uma técnica qualitativa, enquanto qPCR é uma técnica quantitativa. Esta é a principal diferença entre PCR e qPCR.

Referência:

1. “QPCR vs. PCR digital vs. PCR tradicional”. Thermo Fisher Scientific, disponível aqui.

Cortesia de imagem:

1. “PCR” de Madprime - Trabalho do próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia2. “Taqman” por usuário: Braindamaged - Própria obra do uploader original (domínio público) via Commons Wikimedia