o principal diferença entre a extração de DNA e RNA é que o nível de pH de A extração de DNA é pH 8, enquanto o nível de pH da extração de RNA é pH 4,7. O DNA tende a desnaturar e passar para a fase orgânica em pH ácido. Em pH alcalino, o RNA sofre hidrólise alcalina devido à presença de 2 ′ OH no açúcar ribose.

A extração de DNA e RNA são os dois procedimentos envolvidos no isolamento e purificação dos ácidos nucléicos das células dos tecidos. Ambos os procedimentos consistem em três etapas. DNA e RNA de boa qualidade desempenham um papel crítico em experimentos de biologia molecular, biotecnologia, genômica e epidemiologia.

Principais áreas cobertas

1. O que é extração de DNA - Definição, Procedimento 2. O que é extração de RNA - Definição, Procedimento 3. Quais são as semelhanças entre a extração de DNA e RNA - Esboço de características comuns 4. Qual é a diferença entre extração de DNA e RNA - Comparação das principais diferenças

Termos-chave: Lise Celular, Desnaturação de Proteínas, Extração de DNA, pH, Precipitação, Extração de RNA

O que é extração de DNA

A extração de DNA é o procedimento de isolamento e purificação do DNA. O DNA pode ser isolado de sangue, amostras de tecido congeladas ou blocos de tecido de parafina. As três etapas da extração do DNA são a lise celular, o isolamento do DNA e a precipitação. Durante a lise celular, as barreiras da membrana celular, como a membrana celular e as membranas do núcleo, se abrem para expor o DNA. A próxima etapa é a remoção dos lipídios da membrana da amostra. Finalmente, a precipitação do DNA envolve a remoção de proteínas associadas ao DNA pela protease e a remoção do RNA pela RNase.

Figura 1: Procedimento de extração de DNA

Protocolos Básicos de Extração de DNA

Abaixo são mostrados os protocolos básicos de extração de DNA.

1. Lise celular com o tampão de lise celular para lisar as membranas celulares

2. Os lipídios são decompostos com detergentes e surfactantes

3. Digestão de proteínas pela adição de protease

4. Digestão de RNA pela adição de RNase

5. Separação de detritos celulares, proteínas digeridas, lipídios e RNA pela adição de sal concentrado seguido de centrifugação

6. Precipitação de DNA em etanol com etanol ou isopropanol gelado. A força iônica do acetato de sódio pode ser usada para melhorar a precipitação. O DNA precipitado aparece como fios na solução final.

Figura 2: DNA extraído

A extração de fenol-clorofórmio também pode ser usada para separar o DNA das proteínas. Aqui, o fenol desnatura as proteínas da amostra e o DNA permanece na fase aquosa ao final da extração. E, na fase orgânica, estão as proteínas desnaturadas. Outro método para extrair DNA é a purificação por minicoluna. Aqui, a ligação do DNA na coluna depende do pH e da concentração de sal do tampão.

O que é extração de RNA

Extração de RNA refere-se ao processo de purificação de RNA de amostras. O método convencional de extração de RNA é chamado de extração de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio. O tiocianato de guanidínio desnatura as proteínas. Além disso, ele interrompe as ligações de hidrogênio das moléculas de água e atua como agente caotrópico. Um reagente especial é usado na extração de RNA chamado de Tri-reagente. Ele contém tiocianato de guanidínio, fenol e acetato de sódio. O objetivo das etapas básicas da extração de RNA é semelhante ao da extração de DNA. O protocolo para extração de RNA é descrito abaixo.

1. As células são lavadas com PBS gelado para manter a osmolaridade das células.

2. Aspire as células e homogeneize a amostra com Tri-reagente.

3. Adicione clorofórmio e agite.

4. A centrifugação pode resultar em três camadas. A camada superior é a camada aquosa, que é transparente. A camada intermediária ou a interfase contém o DNA precipitado. A camada inferior é a camada orgânica, que é rosa.

5. Remova a camada aquosa e adicione isopropanol. A centrifugação pode resultar em um pellet.

6. Lave o pellet com etanol 75%. Seque o pellet ao ar.

7. Dissolva o pellet com tampão TE ou água.

Figura 3: Extração de fenol-clorofórmio de RNA

A extração de RNA é geralmente realizada em pH abaixo de 7. Em pH alcalino, o RNA é mais propenso a ser degradado por hidrólise alcalina devido à presença de um grupo OH na posição 2 'do açúcar ribose. Além disso, o RNA tende a permanecer na fase aquosa em pH ácido. Por outro lado, o DNA tende a desnaturar e passar para a fase orgânica em pH ácido. Portanto, a extração de DNA pode ser realizada em cerca de pH 8. O DNA é feito de açúcar desoxirribose e não sofre hidrólise alcalina.

Semelhanças entre extração de DNA e RNA

Diferença entre extração de DNA e RNA

Definição

Extração de DNA: Procedimento de isolamento e purificação de DNA

Extração de RNA: Processo de purificação de RNA de amostras

Tipo de ácido nucléico extraído

Extração de DNA: DNA

Extração de RNA: RNA

pH

Extração de DNA: Feito às 8

Extração de RNA: Feito em 4.7

Passos

Extração de DNA: Quebrando as membranas celulares ou lise celular, removendo os lipídios da membrana e precipitando o DNA

Extração de RNA: Lise celular, extração de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio, preparação com isopropanol

Uso de água tratada com DEPC

Extração de DNA: Nenhum

Extração de RNA: Todos os reagentes são preparados com água tratada com DEPC

Armazenar

Extração de DNA: O DNA pode ser extraído antes e é armazenado em lotes

Extração de RNA: A extração de RNA é feita um pouco antes dos procedimentos a jusante

Armazenamento de longo prazo

Extração de DNA: A -20 ° C

Extração de RNA: A -80 ° C

Conclusão

A extração de DNA é realizada em pH 8. O DNA tende a passar para a fase orgânica, pois desnatura em pH ácido. Mas, a extração de RNA é realizada em pH baixo para evitar a degradação por hidrólise alcalina. O objetivo básico das etapas de extração de DNA e RNA é semelhante. A principal diferença entre a extração de DNA e RNA são as condições de pH utilizadas em cada tipo de extração.

Referência:

1. “Os princípios básicos da extração de DNA”. Alaska BioPREP Virtual Textbook, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, disponível aqui2. “Protocolo de Isolamento de RNA e Transcrição Reversa: Células em Cultura”. abcam, disponível aqui

Cortesia de imagem:

1. “Figura 17 01 02” Por CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia 2. “Extração de DNA” Por Joo Nath - Trabalho próprio (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia 3. “Extração PhOH-CHCl3” Por Squidonius () - Trabalho do próprio (Texto original: feito por ele mesmo) (Domínio Público) via Commons Wikimedia