Os primers são um componente essencial na amplificação do DNA in vivo e in vitro. In vivo, a enzima DNA polimerase requer um primer para o início da replicação do DNA. In vitro, os primers são usados ​​principalmente para a iniciação da reação em cadeia da polimerase (PCR). Algumas outras técnicas, incluindo sequenciamento, clonagem, mutagênese dirigida ao local, etc. requerem primers. Portanto, o projeto de primers para técnicas in vitro torna-se bastante simples, mas um processo desafiador para biólogos moleculares. Portanto, as regras básicas para o projeto de primer para PCR e sequenciamento são discutidas neste artigo.

Principais áreas cobertas

1. O que é um Primer - Definição, Tipos, Papel 2. Como funcionam os primers em um PCR - Características do DNA, Processo de PCR 3. Como fazer primers para PCR - Regras básicas para projetar primers de PCR 4. Como projetar um primer de sequenciamento - Características dos primers de sequenciamento

Termos-chave: síntese de DNA, primers diretos, comprimento, temperatura de fusão, PCR, primers reversos, primers de sequenciamento

O que é uma cartilha

Um primer é uma fita curta de DNA ou RNA que serve como ponto de partida para a síntese de DNA. As enzimas que catalisam a replicação do DNA são capazes de adicionar nucleotídeos a uma extremidade 3 'existente. Conseqüentemente, o primer estabelece a base para a síntese de DNA ao servir como um primo. Primers de RNA são usados ​​dentro da célula para a iniciação da replicação do DNA pela DNA polimerase. No entanto, sintético Primers de DNA pode ser usado para a amplificação de DNA, principalmente por PCR e outras técnicas. Dois tipos de primers são usados ​​na PCR e são conhecidos como primers forward e reverse. Durante a PCR, milhões de cópias do fragmento de DNA desejado podem ser produzidas flanqueando essa sequência de DNA particular no DNA genômico por iniciadores diretos e reversos. Os primers forward e reverse que flanqueiam uma sequência de DNA específica são mostrados na figura 1.

Figura 1: Primers direto e reverso

Como funcionam os primers em PCR

O DNA é uma molécula com duas fitas que são mantidas juntas. O padrão de par de bases é complementar a cada um em ambas as vertentes. As duas fitas são mantidas juntas pelas ligações de hidrogênio entre bases de nitrogênio complementares. Além disso, cada fio tem sua própria direcionalidade. Uma fita tem direcionalidade de 5 'para 3', enquanto a outra tem direcionalidade de 3 'para 5'. Portanto, as duas fitas são antiparalelas. A fita com direção de 5 ′ a 3 ′ é conhecida como fita sense, enquanto a fita com direção de 3 ′ a 5 ′ é conhecida como fita antisense. Cada duas fitas devem ser sintetizadas individualmente durante a PCR.

As três etapas da PCR são desnaturação, anelamento e alongamento. Na desnaturação, as duas fitas de DNA são separadas quebrando as ligações de hidrogênio por aquecimento a 95 ° C. O primer forward se liga à fita sense, enquanto o primer reverso se liga à fita antisense. O recozimento dos primers ocorre quando a temperatura cai de 95 ° C para 50-60 ° C. Portanto, ambas as fitas podem ser sintetizadas ao mesmo tempo com a ajuda da Taq polimerase. A amplificação das fitas sense e antisense ocorre na direção de 5 ′ a 3 ′. Como o PCR é uma reação exponencial, as três etapas são repetidas em 25-35 ciclos. Os primers direto e reverso são usados ​​em cada ciclo para produzir cerca de 2³⁵ cópias do fragmento de DNA desejado. O papel dos primers na PCR é mostrado na figura 2.

Figura 2: PCR

Como fazer primers para PCR

Para amplificar um fragmento de DNA particular no genoma, esse fragmento de DNA particular deve ser flanqueado por primers direto e reverso. Portanto, ambos os primers devem ser complementares às sequências que flanqueiam o fragmento de DNA. As diretrizes básicas para o design bem-sucedido de primers de PCR são descritas abaixo.

1. A direção do primer direto e reverso deve ser de 5 ′ a 3 ′.
2. O comprimento de cada primer deve ser entre 18 a 25 nucleotídeos de comprimento.
3. O conteúdo de GC dos primers está entre 40 e 60% e a presença de um C ou G na extremidade 3 'do primer pode promover a ligação.
4. A temperatura de fusão e a Tm (a temperatura na qual metade do primer se recozeu com o molde) do par de primer deve ser semelhante e acima de 60 ° C. A diferença máxima deve ser de 5 ° C.
5. A extremidade 3 'do primer deve corresponder exatamente ao DNA modelo.
6. Pelo menos bases 2G ou C (garra GC) devem estar presentes nas últimas 5 bases na extremidade 3 ′ do primer. O grampo GC promove uma forte ligação à sequência alvo.
7. Sítios de restrição com 5-6 nucleotídeos podem ser adicionados à extremidade 5 'do primer.
8. As repetições do dinucleotídeo (ATATATAT) ou do mesmo nucleotídeo mais de 4 vezes (ACCCC) devem ser evitadas nas sequências de primer. Isso causa má abertura.
9. A homologia intra-primer ou as estruturas secundárias dos primers devem ser evitadas. A homologia inter-primer ou sequências complementares nos primers direto e reverso devem ser evitadas. Ambas as condições podem formar dímeros próprios ou dímeros primários.
10. O valor ΔG para análise de dímero deve estar entre 0 a -9 kcal / mol.

Muitas ferramentas online estão disponíveis para facilitar o design do primer, como Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar, etc. A especificidade dos primers projetados pode ser determinada por ferramentas como NCBI Primer-BLAST ou UCSC in-silico PCR.

Figura 3: Interface do Primer 3

Como projetar um primer de sequenciamento

Os primers de sequenciamento são curtos, filamentos de DNA, assim como os primers de PCR. No entanto, os iniciadores de PCR são concebidos para a amplificação de um fragmento de DNA particular, enquanto os iniciadores de sequenciação são usados ​​para revelar a sequência de nucleótidos do fragmento de DNA amplificado por PCR. Ao contrário dos iniciadores de PCR, um único iniciador pode ser usado no sequenciamento, se apenas a sequência alvo tiver menos de 500 bp de comprimento. Como um exemplo, o primer direto da PCR pode ser usado no sequenciamento, para amplificar apenas a fita com sentido. Além disso, o grau de incompatibilidades tolerado durante a reação de sequenciamento é maior do que o PCR. Geralmente, os primers de PCR são complementares à sequência alvo. No entanto, alguns primers de sequenciação não estão relacionados com a sequência alvo. Eles são conhecidos como primers universais. Iniciadores universais, como T7 ou SP6 emparelham com o vetor que carrega a sequência alvo. Eles podem ser usados ​​para uma variedade de vetores e vários tipos de fragmentos de DNA.

Conclusão

Os primers são usados ​​em PCR e sequenciamento para o início da síntese de DNA. Dois tipos de primers de PCR podem ser identificados como primer direto e reverso. Os primers forward recozem para a fita sense, enquanto os primers reversos recozem para a fita antisense. No sequenciamento, o primer direto ou reverso pode ser usado para amplificar o alvo. Durante o projeto de primers, muitos fatores devem ser considerados, como comprimento do primer, Tm e conteúdo de GC. Muitas ferramentas online estão disponíveis que podem ser usadas para projetar primers para uma sequência particular.

Referência:

1. “Projeto do Primer: Dicas para um Processo Eficiente.” Genome Compiler Corporation, 3 de novembro de 2015, disponível aqui. 2. “Primers de sequenciamento e design de primer.” Primers de sequenciamento e projeto de primer, University of Calgary, disponíveis aqui.

Cortesia de imagem:

1. “Primers RevComp” de Zephyris - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. “Reação em cadeia da polimerase” Por Enzoklop - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia