As combinações oligo-dT / transportador são usadas principalmente na purificação de mRNA de RNA total por uma técnica conhecida como cromatografia de afinidade. Existem dois métodos principais para isolar o mRNA do RNA total com base no tipo de células; a saber, método direto de isolamento de mRNA e método menos de isolamento de mRNA. Ambos os métodos são explicados neste artigo.

O RNA mensageiro (mRNA) é um produto da transcrição, composto por uma série de nucleotídeos de RNA. Ele carrega informações em genes do núcleo ao citoplasma para a síntese de proteínas. O isolamento de RNA de uma determinada linha celular resulta em RNA total, que consiste em rRNAs e tRNAs juntamente com mRNAs. Portanto, o mRNA deve ser separado da mistura de RNA total durante o estudo do transcriptoma da linha celular. Propriedades únicas de mRNA, como a presença de uma cauda poli (A) na extremidade 3 'da molécula de mRNA, são usadas para a separação. Uma vez que as moléculas de oligo-dT são complementares à cauda poli (A), o mRNA pode ser isolado de uma mistura de RNA total.

Principais áreas cobertas

1. O que é mRNA - Definição, Estrutura, Função 2. Qual é a composição do RNA total - mRNA, rRNA, tRNA 3. Como isolar mRNA do RNA total - Uso de oligo-dT / moléculas transportadoras

Termos-chave: cromatografia de afinidade, RNA mensageiro (mRNA), método menos, Oligo dT, cauda poli (A), RNA total

O que é mRNA

O mRNA é um transcrito de um gene codificador de proteína. É produzido dentro do núcleo em eucariotos e carrega informações para a produção de uma determinada proteína no citoplasma. É traduzido em uma sequência de aminoácidos da proteína durante a tradução, assistida por ribossomos. A transcrição primária produzida pela transcrição de eucariotos é chamada de pré-mRNA.

Figura 1: Estrutura do mRNA

Durante as modificações pós-transcricionais, uma molécula de mRNA madura é produzida com vários recursos, como capa 5 'e cauda poli (A). O mRNA total de um determinado organismo é conhecido como seu transcriptoma.

Qual é a composição do RNA total

O resultado do isolamento do RNA é chamado de RNA total. É composto por todos os três tipos principais de RNA produzidos por uma célula. Eles são mRNA, tRNA e rRNA. Tanto o tRNA quanto o rRNA auxiliam na tradução. O tamanho do mRNA eucariótico é de 0,5-20 kb. O RNA de transferência (tRNA) traz os aminoácidos correspondentes durante a tradução. Tem 76-90 pares de bases de comprimento e é composto de uma região anticódon, que é complementar a um códon particular no mRNA. O RNA ribossomal (rRNA) é um componente dos ribossomos. Alguns dos rRNAs humanos têm 5 kb de comprimento.

Mais de 90% do RNA total é composto de tRNA e rRNA. Apenas 1-5% do RNA total é mRNA. Uma célula típica de mamífero pode consistir em aproximadamente 500.000 moléculas de mRNA por célula. A quantidade de um tipo específico de mRNA pode ser de 15 a 20.000 cópias por célula.

Como isolar mRNA do RNA total

Uma série de técnicas de biologia molecular, como construção de biblioteca de cDNA, preparação de amostra para preparação de microarray, análise de Northern blot para genes fracamente expressos, etc. requerem mRNA de alta qualidade. Existem dois métodos principais para isolar mRNA de RNA total com base no tipo de células: método direto de isolamento de mRNA e método menos de isolamento de mRNA.

Método direto de isolamento de mRNA

O princípio da separação do mRNA maduro do RNA total eucariótico envolve a seleção por afinidade / cromatografia de afinidade do mRNA poliadenilado com o uso de oligo dT (oligodesoxtimidilato), que é complementar à cauda poli (A). Isso é possível pela ausência de uma cauda poli (A) nos dois outros tipos de RNA: tRNA e rRNA.

O mRNA consiste em 30-200 nucleotídeos de adenina em sua cauda poli (A). Colunas de afinidade preenchidas com combinação oligo dT / transportador são usadas no isolamento de mRNA de RNA total. A combinação oligo dT / transportador pode ser oligo dT ligado a celulose, oligo dT biotinilado com contas magnéticas acopladas a estreptavidina ou contas de látex de poliestireno acopladas a oligo dT. Todas as condições experimentais devem estar em condições livres de RNase para prevenir a degradação enzimática do RNA.

Figura 2: Cromatografia de Afinidade

O RNA total deve ser dissolvido em um tampão de alto teor de sal e aquecido brevemente a 65-70 ° C para interromper as estruturas secundárias do RNA. As condições para o isolamento do RNA variam entre os kits comercialmente disponíveis para o isolamento do mRNA. No entanto, a preparação de poli (A) -RNA ou mRNA é composta por três etapas.

1. Hibridização de poli (A) -RNA para moléculas de oligo dT conectadas a um transportador
2. Lavagem de RNA não ligado
3. Eluição de poli (A) -RNA da combinação oligo-dT / transportador sob condições de baixo rigor

Método menos de isolamento de mRNA

A purificação de mRNA baseada em oligo dT só produz mRNA com uma cauda poli (A) ou mRNA eucariótico maduro. Portanto, outro método conhecido como método menos pode ser usado na purificação de mRNA que não tem uma cauda poli (A). Este método pode ser usado no isolamento de mRNA de levedura e RNA bacteriano total. Também pode ser usado no isolamento de tipo imaturo de mRNA juntamente com o mRNA maduro de células eucarióticas. Envolve o enriquecimento do transcriptoma eliminando o grande RNA ribossômico do RNA total. O RiboMinus^TM O kit de isolamento de transcriptoma da ThermoFisher Scientific usa três etapas na purificação eficiente de mRNA de leveduras e do RNA bacteriano total.

1. Hibridização de RNA total com sondas de oligonucleotídeos marcadas com biotina 5 ', específicas para a sequência de rRNA
2. Remoção do complexo de sonda marcada com rRNA / 5′-biotina juntamente com as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina
3. Purificação de impurezas e eluição de mRNA.

Conclusão

O RNA total é composto por três tipos principais de RNA: mRNA, rRNA e tRNA. A purificação do mRNA do RNA total é essencial para a análise do transcriptoma de um determinado organismo. Os métodos de purificação são baseados no tipo de mRNA. O mRNA eucariótico, que contém uma cauda poli (A), pode ser isolado por cromatografia de afinidade com oligo dT. O mRNA eucariótico imaturo e o mRNA de células de levedura e bacterianas podem ser isolados pela depleção de rRNA grande do RNA total.

Referência:

1. “Extração de mRNA.” Thermo Fisher Scientific, disponível aqui. 2. ”Extração de RNA por tipo de RNA”. Thermo Fisher Scientific, disponível aqui.

Cortesia de imagem:

1. “Maduro mRNA” (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. “Afinidade” por Jamit em Inglês Wikilivros - Transferido de en.wikibooks para Commons por Adrignola usando CommonsHelper (Domínio Público) via Commons Wikimedia