Como Tornar Linha Celular Transfectada Estável

Índice:

Como Tornar Linha Celular Transfectada Estável
Como selecionar DNA transfectado em linhas celulares

A transfecção estável é a introdução a longo prazo de DNA estranho nas células. As células transfectadas de forma estável passam o DNA estranho através da progênie. Portanto, para fazer linhas de células transfectadas de forma estável, o DNA estranho deve ser integrado no genoma da linha de células. No entanto, a herança estável também pode ser observada no DNA não genômico. Uma transfecção estável e bem-sucedida requer métodos eficazes de entrega de DNA, bem como métodos de seleção para DNA estranho dentro da linha celular. Linhas celulares transfectadas de forma estável são usadas para uma ampla gama de aplicações, como a produção de proteínas recombinantes, estudos de função gênica, ensaios de descoberta de drogas, etc.

Principais áreas cobertas

1. Como fazer linha celular transfectada estável - Protocolo de geração de linha celular estável 2. Como selecionar DNA transfectado em linha celular - Seleção de linha celular transfectada de forma estável

Termos-chave: Manutenção Episomal, Integração no Genoma, Plasmídeo, Seleção, Linhas de Células Transfectadas de Forma Estável

Como Tornar Linha Celular Transfectada Estável

A transfecção é um método de transferência de genes em que o material genético é deliberadamente introduzido na célula hospedeira por métodos químicos ou não químicos. Existem dois tipos de linhas celulares transfectadas de forma estável:

O principal tipo de linhagem de células estáveis é gerado pela integração direta do DNA transfectado no genoma do organismo hospedeiro. O DNA transfectado é integrado no genoma por recombinação homóloga.
O outro método para gerar linhas celulares estáveis é a manutenção epissomal do DNA transfectado. Os vetores eucarióticos são usados na transfecção de DNA que não está integrado no genoma. No entanto, a estabilidade do DNA epissomal é baixa. Além disso, os epissomas são mantidos apenas por certos tipos de espécies. As linhas celulares transfectadas de forma estável são mostradas na figura 1.

Figura 1: Linhas celulares estavelmente transfectadas

Processo

As etapas envolvidas na geração de linhas celulares estáveis são descritas abaixo.

Geração de uma curva de morte que determina a concentração de antibiótico de seleção ideal - as células são submetidas a quantidades crescentes de concentração de antibiótico para determinar a concentração mínima de antibiótico necessária para matar todas as células ao longo de uma semana.
Transfecção de células com a construção de plasmídeo desejada - O método de transfecção difere com o tipo de células hospedeiras. Os reagentes de lipossomas são usados na transfecção de linhas de células aderentes. Métodos de eletrotransfecção ou virais são usados para transfectar linhas de células em suspensão.
Selecionar e expandir colônias policlonais estáveis - Em 48-72 horas de transfecção, altas, ótimas e baixas concentrações de antibióticos seletivos são adicionadas às culturas para obter as linhas de células transfectadas de forma estável.

Como selecionar DNA transfectado em linhas celulares

Os marcadores de seleção são co-expressos com o DNA transfectado para a seleção de células transfectadas com sucesso. O gene marcador pode estar no mesmo vetor (cis) usado para transfectar a célula hospedeira ou em outro vetor (trans). A resistência a antibióticos, como neomicina, zeocina, higromicina, puromicina, DHFR, etc. pode ser usada na seleção. Além disso, os genes transfectados podem ser marcados com GFP.

Conclusão

As linhas celulares estáveis podem ser feitas principalmente integrando o DNA transfectado no genoma. Além disso, a manutenção epissomal do DNA transfectado também pode ser usada para fazer linhas celulares estáveis por um longo período de tempo em alguns organismos hospedeiros. Deve haver um método de seleção para a identificação do DNA transfectado na linha celular.