Como projetar primários para mutagênese direcionada ao local

Índice:

O que é mutagênese direcionada ao local
Como projetar primers para mutagênese direcionada ao local

A mutagênese dirigida ao local (SDM) é um método in vitro de criação de uma mutação em uma sequência conhecida. Freqüentemente, é realizado por métodos baseados em PCR. Normalmente, uma ou duas bases são alteradas na mutagênese dirigida ao local. Os iniciadores podem ser projetados com as mutações desejadas para a introdução de pequenas alterações na sequência de nucleotídeos. A extensão do primer e a PCR inversa podem ser usadas para introduzir mutações em grande escala. Esta abordagem pode alterar a composição de aminoácidos de uma proteína particular. A mutagênese dirigida ao local é usada para estudar as alterações da atividade das proteínas. Também é usado para criar proteínas de fusão.

Principais áreas cobertas

1. O que é mutagênese direcionada ao local (SDM) - Definição, Papel, Método 2. Como projetar primers para mutagênese direcionada ao local - Substituições, exclusões, inserções

Termos-chave: exclusões, inserções, mutações, mutagênese direcionada ao local, substituições, PCR tradicional

O que é mutagênese direcionada ao local

A mutagênese dirigida ao local é uma técnica de biologia molecular usada para introduzir mudanças específicas em uma sequência de nucleotídeos de um gene. É usado para alterar a sequência de aminoácidos de uma proteína, introduzir ou remover locais de restrição, destruir locais de ligação da transcrição e criar proteínas de fusão.

Processo

Durante a mutagênese dirigida ao local, as mutações são introduzidas nos plasmídeos usando iniciadores, consistindo na mutação desejada. Todo o modelo é amplificado por PCR, incorporando a mutação ao modelo. Em seguida, o modelo parental é removido da amostra com o uso de uma enzima, endonuclease dependente de metilação. O produto de PCR ou a molécula de plasmídeo cortado com a mutação desejada é transformado em bactérias. Os plasmídeos podem ser isolados das bactérias com as modificações desejadas. O processo de mutagênese dirigida ao local é mostrado na figura 1.

Figura 1: Mutagênese Dirigida ao Local

Três tipos principais de métodos são usados para introduzir as mutações desejadas na mutagênese dirigida ao local. Eles são PCR tradicional, extensão de primer e PCR inverso. A extensão do iniciador e a PCR inversa podem ser usadas para introduzir alterações de nucleotídeos em grande escala.

PCR tradicional

A PCR tradicional pode ser usada para introduzir uma ou duas alterações de nucleotídeos na sequência alvo com iniciadores modificados. As alterações podem ser substituições, deleções ou adições de nucleotídeos. A mutação é incorporada ao amplicon durante a PCR. Portanto, a sequência original é substituída pela sequência mutada no primer.

Extensão de primer

Na extensão do primer, a mutação desejada é incorporada durante um PCR interno. Aqui, a sequência alvo é flanqueada por dois iniciadores. A mutação desejada é incorporada ao primer interno e, a mutação é introduzida na segunda rodada de PCR. Geralmente, a especificidade de uma reação de PCR diminui com o aumento do número de nucleotídeos incompatíveis nos primers. No entanto, primers internos longos com mutações em grande escala podem ser usados na extensão do primer, pois a PCR interna pode aumentar a especificidade da reação de PCR.

PCR inverso

PCR inverso é um método de amplificação de fragmentos de DNA desconhecidos, projetando primers para uma sequência de DNA conhecida. Ele pode ser usado para substituir, excluir ou inserir nucleotídeos em grande escala.

As aplicações da mutagênese dirigida ao local são descritas abaixo.

Para estudar a estrutura, função e propriedades catalíticas das proteínas
Para melhorar as propriedades das proteínas (engenharia de proteínas)
Para introduzir ou remover locais de endonucleases de restrição.

Como projetar primers para mutagênese direcionada ao local

A mutagênese dirigida ao local é um processo de introdução da mutação desejada por meio de um primer. A mutação pode ser uma substituição, inserção ou deleção. À medida que a especificidade da PCR diminui com o aumento dos nucleotídeos incompatíveis no primer, a PCR tradicional só pode introduzir alterações de um ou dois pares de bases na sequência alvo. Outros métodos, como extensão de primer e PCR inverso, podem ser usados para introduzir mutações em grande escala. O desenho do primer na mutagênese dirigida ao local é mostrado na figura 2.

Figura 2: Primers para mutagênese direcionada ao local

Substituição

Para substituições, um dos dois primers deve conter a mutação desejada no meio do primer. Aqui, o local que contém a mutação não se emparelha com a sequência alvo, pois forma uma distorção.

Eliminação

Para exclusões, a sequência a ser excluída do alvo pode ser negligenciada durante o projeto do primer. Como esta sequência está situada separada da região flanqueada por iniciadores, ela não seria amplificada durante a PCR.

Inserção

Para as inserções, a sequência a ser adicionada é emaranhada na extremidade 5 'de um dos primers durante o projeto do primer. Portanto, a sequência inserida pode permanecer anexada ao amplicon também.

Conclusão

A mutagênese dirigida ao local é uma técnica usada para introduzir mutações em uma sequência de DNA. Essas mutações podem ser substituições, inserções ou deleções. Mutações em pequena escala podem ser introduzidas na PCR tradicional. Mutações em grande escala podem ser introduzidas na extensão do primer ou PCR inverso. A introdução da mutação é feita por incorporação da mutação desejada ao primer.