A PCR quantitativa ou em tempo real é usada como um ensaio de rotina para monitorar as mudanças relativas na expressão gênica em diferentes condições experimentais. O projeto de primers e sondas durante o QPCR é um dos fatores mais importantes que afetam a qualidade e o sucesso do ensaio. Várias diretrizes são aplicáveis ​​para o projeto de primers para QPCR: o conteúdo de GC dos primers deve ser de 35-65%; a temperatura de fusão dos primers deve estar entre 60-68 ° C; deve-se também evitar estruturas secundárias, as repetições de Gs ou Cs maiores que 3 bases e a formação de dímeros de primer.

Principais áreas cobertas

1. O que é QPCR - Definição, Processo, Usos 2. Como projetar primers para QPCR - Diretrizes para o Design do Primer para QPCR

Termos-chave: corantes fluorescentes, conteúdo de GC, temperatura de fusão, primers, PCR quantitativo (QPCR)

O que é QPCR

QPCR é um tipo de PCR que permite a quantificação do produto em tempo real. Os corantes fluorescentes podem ser usados ​​na quantificação de produtos de PCR, rotulando-os em cada etapa. Dois métodos de marcação fluorescente podem ser usados ​​em ensaios QPCR. Eles são o uso de corantes fluorescentes e as sondas marcadas com fluorescência. Os corantes fluorescentes ligam-se ao produto de PCR enquanto as sondas se anelam com o produto de PCR para formar um DNA triplex estável. O corante fluorescente amplamente utilizado em QPCCR é SYBR Green, enquanto as sondas podem ser Taqman. O uso de sondas na detecção de produtos de PCR durante QPCR fornece resultados mais precisos e aumenta a sensibilidade do ensaio.

Figura 1: Mecanismo de QPCR

Como projetar primers para QPCR

O projeto de primers para QPCR é crucial para aumentar a confiabilidade, precisão e sensibilidade do ensaio. Diretrizes para o projeto de primers QPCR são descritas abaixo.

1. Produto de PCR / tamanho do Amplicon - O tamanho do produto de PCR deve ser de 50-210 pares de bases.
2. Comprimento do primer - O comprimento dos primers deve ser de 19-23 nucleotídeos.
3. Conteúdo de GC - O conteúdo de GC dos primers deve ser de 35-65%.
4. Temperatura de fusão (Tm) - A temperatura de fusão dos primers deve ser 60-68 ° C. A temperatura de recozimento para o ensaio é 5 ° C menor do que a Tm dos primers.
5. Junção exon-exon - Ao amplificar cDNA por QPCR, os primers devem abranger a junção exon-exon para evitar a amplificação de DNA contaminante.
6. Repetições e execuções - Repetições de dinucleotídeos (TCTCTCTCTC) e nucleotídeos repetidos (por exemplo, TAAAAAAAGC) devem ser evitadas.
7. Complementaridade 3 '- As regiões complementares das extremidades 3' dos primers diretos e reversos devem ser evitadas para prevenir a formação de dímeros de primer.
8. Estabilidade 3 '- resíduos G ou C devem ser incluídos na extremidade 3' do primer para aumentar a estabilidade do recozimento.
9. Grampo GC - Um ou dois grampos GC na extremidade 5 'do primer aumentam a especificidade do recozimento.
10. Especificidade - A especificidade dos primers deve ser verificada pelo BLAST
11. SNPs - os primers não devem conter nenhuma variação conhecida de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único)

Diversas ferramentas online podem ser usadas no projeto de primer em QPCR, como Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank e OAT.

Figura 2: Formação de primer-dímeros

Os primers devem ser projetados de forma a evitar a formação de primers-dímeros em QPCR. É crítico ao usar corantes fluorescentes para a detecção do produto de PCR, uma vez que esses corantes também se ligam aos dímeros de primer para dar resultados falsos positivos.

Conclusão

QPCR é usado na detecção e quantificação de produtos de PCR. O projeto de primers é crucial em QPCR para aumentar a precisão dos resultados. Portanto, é importante seguir cuidadosamente as diretrizes ao projetar primers para QPCR.

Referência:

1. “Design e Otimização do Ensaio QPCR.” LSR | Bio-Rad, disponível aqui.

Cortesia de imagem:

1. “Taqman” do usuário: Braindamaged - Obra do próprio autor do upload (domínio público) via Commons Wikimedia2. “Primer dimersformation En” de Tzachi Bar - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia