Sequenciamento é o processo envolvido na determinação de uma sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA particular. Durante o sequenciamento, o fragmento de DNA é marcado terminalmente com nucleotídeos marcados com fluorescência por PCR. Este processo usa quatro tipos de nucleotídeos marcados com fluorescência, e eles são didesoxinucleotídeos (ddNTPs). Os ddNTPs carecem de um grupo 3 ′ OH ao qual o grupo fosfato do nucleotídeo de entrada está ligado. Portanto, quando um ddNTP é adicionado à cadeia em crescimento, não haverá mais adição de nucleotídeos na extremidade 3 'da cadeia. Isso significa que a adição de um ddNTP à cadeia em crescimento encerra o crescimento da cadeia. Uma vez que os ddNTPs são adicionados à mistura de PCR em baixas concentrações, cada cadeia em crescimento é encerrada em níveis diferentes. A emissão de fluorescência é detectada para determinar a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA no final da PCR.

Principais áreas cobertas

1. O que é sequenciamento de DNA - Definição, Tipos 2. Como funciona o sequenciamento de DNA - Processo de sequenciamento de DNA

Termos-chave: Dideoxinucleotídeos (ddNTPs), Marcador Fluorescente, Eletroforese em Gel, Sequenciamento de Próxima Geração, Sequência de Nucleotídeos, PCR, Sequenciamento Sanger

O que é sequenciamento de DNA

O sequenciamento de DNA é uma técnica de laboratório usada na determinação da sequência de nucleotídeos de uma determinada molécula de DNA. Ele usa nucleotídeos marcados com fluorescência, que são incorporados durante a PCR. Existem dois métodos principais de sequenciamento baseados nas técnicas utilizadas na detecção de fluorescência: sequenciamento Sanger e sequenciamento de última geração.

Sequenciamento Sanger

O sequenciamento Sanger, desenvolvido por Fredric Sanger em 1975, é o primeiro método de sequenciamento desenvolvido. Também é conhecido como método de terminação de cadeia desde está envolvido na incorporação seletiva de ddNTPs de terminação de cadeia durante a síntese de DNA in vitro. No sequenciamento Sanger, os amplicons são separados por eletroforese em gel. O sequenciamento de Sanger é amplamente utilizado para a determinação da sequência dos fragmentos de DNA usados ​​na clonagem e dos fragmentos amplificados por PCR. Uma determinada sequência de DNA é mostrada na figura 1.

Figura 1: Sequenciamento de DNA

Sequenciamento de próxima geração

As tecnologias de sequenciamento de DNA mais recentes são conhecidas coletivamente como sequenciamento de última geração. É também um método de terminação de cadeia. O sequenciamento de próxima geração usa eletroforese capilar para a separação de amplicons com vários comprimentos criados pelo método de terminação de cadeia. O sequenciamento de última geração é usado na determinação de um grande número de nucleotídeos por corrida, como no sequenciamento do genoma.

Como funciona o sequenciamento de DNA

Durante o sequenciamento de DNA, nucleotídeos marcados com fluorescência são adicionados a um fragmento de DNA específico por PCR. Para o alongamento da fita de DNA, são usados ​​desoxinucleotídeos regulares (dNTPs). No entanto, ddNTPs são adicionados à mistura de reação, que é marcada por fluorescência. Uma vez que os ddNTPs não têm um grupo 3 ′ OH na molécula de açúcar desoxirribose, o crescimento adicional da cadeia pode não ocorrer, encerrando o crescimento da cadeia. O esqueleto açúcar-fosfato do DNA é formado pela formação de ligações fosfodiéster entre o grupo 3 ′ OH do açúcar desoxirribose e o grupo fosfato do nucleotídeo de entrada. No entanto, ddNTPs são adicionados em baixas concentrações; portanto, eles não encerram o crescimento da cadeia de uma vez.

Quatro tipos de ddNTPs são adicionados a quatro misturas de PCR separadas. Quatro reações de PCR separadas são realizadas adicionando ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP. Portanto, em cada mistura de reação, o crescimento da cadeia termina nos nucleotídeos A, G, C e T, respectivamente. Como exemplo, na mistura de reação com ddATP adicionado, o crescimento de diferentes amplicons são terminados em cada nucleotídeo A no fragmento de DNA. A determinação da sequência de DNA por sequenciamento Sanger é mostrada na figura 2.

Figura 2: Sequenciamento Sanger

Cada um dos quatro tipos de nucleotídeos é marcado por uma cor de fluorescência separada; a ddATP é marcado com corante verde; a ddGTP é marcado com corante amarelo; a ddCTP é rotulado em azul; a ddTTP é marcado com corante vermelho. Portanto, os amplicons das quatro reações de PCR são rotulados em cores diferentes.

Após a amplificação do fragmento de DNA interessado, os amplicons são separados por eletroforese em gel ou eletroforese capilar. A sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA pode ser determinada pela detecção da fluorescência emissora. A sequência de nucleotídeos de fragmentos longos de 750-1.000 pares de bases pode ser facilmente determinada por execução por sequenciamento de Sanger. No entanto, a determinação da sequência de nucleotídeos de um genoma inteiro permanece questionável devido a um grande número de nucleotídeos nos genomas. No entanto, técnicas de sequenciamento de última geração, como sequenciamento 454, cerca de 20 milhões de pares de bases podem ser lidos por execução única.

Conclusão

O sequenciamento de DNA é uma técnica de biologia molecular usada na determinação da sequência de nucleotídeos de fragmentos de DNA. Durante o sequenciamento, nucleotídeos marcados com fluorescência são adicionados aos fragmentos de DNA por PCR. Ao detectar a emissão de fluorescência, a sequência de nucleotídeos pode ser determinada.

Referência:

1. “Sequenciamento de DNA”. Khan Academy, disponível aqui.

Cortesia de imagem:

1. “Sequência de DNA” Por Sjef - Obra própria, Domínio Público) via Commons Wikimedia 2. “Didesoxy-Methode” Por Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia