O sequenciamento de DNA é uma técnica que ajuda a determinar a sequência de nucleotídeos de uma determinada molécula de DNA. Os dois métodos de sequenciamento são o sequenciamento Sanger e o sequenciamento de última geração. Ambos os tipos de métodos de sequenciamento são totalmente automatizados e atualizados. Qualquer fita de DNA é composta por quatro nucleotídeos: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T). Os nucleotídeos no fragmento de DNA são marcados com quatro marcadores fluorescentes separados em ambos os tipos de métodos de sequenciamento. Os marcadores fluorescentes ou fluoróforos são moléculas capazes de absorver luz e emiti-la em um comprimento de onda bem definido. Os marcadores fluorescentes são incorporados à fita de DNA por PCR. Em seguida, a sequência dos nucleotídeos é determinada por técnicas automatizadas.

Principais áreas cobertas

1. O que é sequenciamento - Definição, Sequenciamento Sanger, Sequenciamento de Próxima Geração 2. Como os marcadores fluorescentes ajudam a determinar uma sequência de nucleotídeos - Procedimento de Sequenciamento

Termos-chave: Dideoxinucleotídeos (ddNTPs), Marcador Fluorescente, Eletroforese em Gel, Sequenciamento de Próxima Geração, Sequência de Nucleotídeos, PCR, Sequenciamento Sanger

O que é sequenciamento

O sequenciamento é uma técnica de laboratório usada para determinar a sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA. Dois tipos principais de métodos de sequenciamento de DNA podem ser identificados como sequenciamento Sanger e sequenciamento de próxima geração. Tanto o sequenciamento Sanger quanto o sequenciamento de próxima geração usam nucleotídeos marcados com fluorescência para a determinação da sequência de nucleotídeos.

Sequenciamento Sanger

O sequenciamento de Sanger é o primeiro método desenvolvido de sequenciamento de DNA. O método de sequenciamento foi desenvolvido pela primeira vez por Fredric Sanger em 1975. Conseqüentemente, é conhecido como sequenciamento de Sanger. O método de sequenciamento Sanger também é conhecido como método de terminação de cadeia uma vez que está envolvido na incorporação seletiva de didesoxinucleotídeos de terminação de cadeia (ddNTPS) pela DNA polimerase durante a síntese de DNA in vitro. O alongamento da fita de DNA é alcançado pelos desoxinucleotídeos regulares (dNTPs). No entanto, ddNTPs são adicionados à mistura de reação para interromper o crescimento da cadeia. Esses ddNTPs são marcados com fluorescência. Os quatro tipos de ddNTPs são adicionados a quatro misturas de PCR separadas. Portanto, quatro reações de PCR separadas são realizadas adicionando ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP. Em cada mistura de reação, o crescimento da cadeia é terminado em cada nucleotídeos A, G, C e T, respectivamente. Como exemplo, na mistura de reação com ddATP adicionado, o crescimento de diferentes amplicons são terminados em cada nucleotídeo A no fragmento de DNA. Em seguida, essas quatro reações são separadas por eletroforese em gel e um fluorômetro é usado para verificar a fluorescência separada. O sequenciamento de Sanger é amplamente utilizado para a determinação da sequência dos fragmentos usados ​​na clonagem de DNA e dos fragmentos amplificados por PCR. As sequências de nucleotídeos determinadas são mostradas na figura 1.

Figura 1: Sequências de DNA

Sequenciamento de próxima geração

As tecnologias de sequenciamento de DNA mais recentes são conhecidas coletivamente como sequenciamento de última geração. As reações de sequenciamento são realizadas em microescala em um chip de uma só vez. Portanto, várias reações de sequenciamento são realizadas em paralelo. No sequenciamento de última geração, a eletroforese capilar é usada além da eletroforese em gel para a separação de amlicons com vários comprimentos criados pelo método de terminação de cadeia. A eletroforese capilar é um método de separação analítica pelo qual as moléculas são separadas com base em sua mobilidade eletroforética.

Como os fabricantes fluorescentes ajudam a determinar uma sequência de nucleotídeos

Durante o sequenciamento, o DNA a ser sequenciado serve como a fita modelo para a síntese de DNA por PCR. Um primer de DNA é usado para o início da síntese de DNA pela DNA polimerase. Uma mistura de quatro bases regulares (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) e um baixo nível de um dos quatro didesoxinucleotídeos (ddNTPs; ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP) são adicionados como componentes da reação de PCR. Portanto, quatro reações de PCR individuais são realizadas pela adição de cada um dos quatro ddNTPs. Os didesoxinucleotídeos possuem duas características especiais:

1. Eles carecem do grupo 3'-OH ao qual o nucleotídeo de entrada é adicionado pela DNA polimerase. Portanto, a incorporação do ddNTP termina o crescimento da cadeia.
2. Eles são marcados com diferentes corantes fluorescentes: o ddATP é rotulado com um corante verde, a ddGTP é marcado com um corante amarelo, a ddCTP é rotulado com azul, e as ddTTP é marcado com corante vermelho.

No entanto, os ddNTPs que terminam a cadeia são adicionados em baixas concentrações; eles não encerram todo o processo de PCR de uma vez. Mas, quando um dos quatro ddNTPs é incorporado na cadeia crescente, o crescimento da cadeia em particular é encerrado. Portanto, ao final de cada quatro reações de PCR, uma série de amplicons (os fragmentos de DNA resultantes da PCR) são produzidos, os quais terminam em cada nucleotídeo do fragmento de DNA alvo. Esses amplicons podem ser executados em um gel. Os corantes fluorescentes que passam em um ponto definido do gel eletroforético podem ser escaneados por um fluorômetro para determinar a sequência de nucleotídeos nos sequenciadores de DNA automatizados. A sequência de nucleotídeos marcada com fluorescência obtida no sequenciamento de DNA é mostrada na figura 2.

Figura 2: Sequência de Nucleotídeos Marcada com Fluorescente

Combinando cada um dos nucleotídeos da série, a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA inicial pode ser determinada. A sequência de nucleotídeos de um fragmento com 750-1.000 pares de bases pode ser facilmente determinada por execução por sequenciamento de Sanger. No entanto, o sequenciamento de um genoma inteiro ainda permanece questionável devido à presença de um grande número de nucleotídeos. O sequenciamento 454 é um tipo de sequenciamento de próxima geração pelo qual 20 milhões de pares de bases podem ser lidos por execução única.

Conclusão

O sequenciamento é uma técnica usada na determinação da sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA particular. O sequenciamento Sanger e o sequenciamento de última geração são as duas principais tecnologias de sequenciamento. Ambas as tecnologias usam marcadores fluorescentes para a determinação da sequência de nucleotídeos. Cada um dos quatro didesoxinucleotídeos de terminação de cadeia é marcado com quatro corantes fluorescentes diferentes e são usados ​​em quatro reações de PCR separadas para obter a sequência.

Referência:

1. Adams, Jill U. "DNA Sequencing Technologies." Nature News, Nature Publishing Group, disponível aqui. 2. Carr, Steven M. Fluorescent sequencing, disponível aqui. 3. “Sequencing DNA - Automated Sequencing With Fluorescent Dyes.” Artigos do JRank, disponíveis aqui.

Cortesia de imagem:

1. “Alineando secuencias (2)” por Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) via Flickr 2. “Radioactive Fluorescent Seq” Por Abizar na Wikipedia em inglês (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia