Southern blotting é uma técnica usada para a detecção de fragmentos de DNA específicos dentro de uma amostra. A técnica de blotting envolve a separação de fragmentos de DNA com base no tamanho por meio de eletroforese em gel, a transferência da amostra de DNA fracionada para uma membrana de filtro, a hibridização dos fragmentos de DNA específicos com uma sonda específica para a sequência marcada e a detecção das bandas marcadas.

Além da identificação de DNA específico em uma amostra, o tamanho e a abundância de um tipo particular de DNA também podem ser determinados por Southern blotting. O processo envolvido no Southern blotting é descrito neste artigo.

Principais áreas cobertas

1. O que é Southern Blotting - Definição, Princípio, Aplicações 2. Como funciona o Southern Blotting - Processo de Southern Blotting

Termos-chave: DNA, Eletroforese em Gel, Sonda de Hibridização, Membrana de Nylon, Digestão de Restrição, Southern Blotting

O que é Southern Blotting

Southern blotting é uma técnica de hibridização usada na identificação de DNA específico em uma amostra. A técnica foi desenvolvida pela primeira vez por Edward M. Southern em 1975. Este processo identifica sequências de DNA, tamanho e abundância de uma sequência de DNA particular dentro de uma amostra.

Uma membrana Southern blotting é mostrada na figura 1.

Figura 1: Membrana Southern Blotting

Aplicações do Southern Blotting

As aplicações de Southern blotting são descritas abaixo.

1. Para detectar um fragmento de DNA particular
2. Para isolar um fragmento de DNA particular
3. Para identificar mutações e rearranjos de genes
4. Em ensaios RFLP (polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição)
5. Para identificar doenças genéticas
6. Para identificar agentes infecciosos
7. Teste de paternidade
8. Em impressões digitais de DNA para identificar criminosos

Como funciona o Southern Blotting

O Southern blotting envolve a separação de fragmentos de DNA com base no tamanho por meio de eletroforese em gel, transferindo-os para uma membrana, hibridizando-os com uma sonda marcada e específica para a sequência e detectando as bandas marcadas. As etapas de Southern blotting são descritas abaixo.

1. Digestão de DNA - A amostra de DNA é digerida por enzimas de restrição para obter fragmentos de DNA, e esses fragmentos são amplificados por PCR.
2. Eletroforese em gel - os fragmentos de DNA são fracionados por tamanho por eletroforese em gel.
3. Desnaturação - O gel com DNA fracionado é embebido em NaOH ou HCl para desnaturar o DNA de fita dupla.
4. Blotting - Fragmentos de DNA no gel são transferidos para uma membrana de náilon carregada positivamente por um processo chamado blotting.
5. Assar e bloquear - O papel mata-borrão com fragmentos de DNA é cozido para fixar o DNA na membrana. Em seguida, os locais de ligação desocupados são saturados por tratamento com albumina de soro bovino (BSA) ou caseína.
6. Hibridização com sondas marcadas - A membrana ligada ao DNA é tratada com uma sonda marcada que contém a sequência de nucleotídeos complementar ao fragmento de DNA interessado. As sondas de hibridização têm geralmente 100-500 bp de comprimento e são marcadas com nucleotídeos radioativos.
7. Visualização por autoradiograma - A membrana ligada à sonda é visualizada sob autoradiograma para obter os padrões do fragmento de DNA interessado.

Figura 2: Southern Blotting

Todo o processo de Southern blotting é mostrado na figura 2.

Conclusão

Southern blotting é uma técnica de hibridização usada na identificação de sequências de DNA específicas de uma amostra. Nesse processo, a amostra de DNA é fracionada por enzimas de restrição e a mistura é executada em um gel. Em seguida, o padrão de bandas no gel é transferido para uma membrana de náilon e hibridizado com uma sonda marcada, o que permite a detecção do fragmento de interesse.

Referência:

1. “Southern Blotting”. Thermo Fisher Scientific, disponível aqui.

Cortesia de imagem:

1. “Southern blot membrana” Por Bojan Žunar - Trabalho do próprio (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia2. “Figura 17 01 05” Por CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia