Western blotting é uma técnica em biologia molecular usada na detecção de uma proteína específica em uma amostra. Ele usa SDS-PAGE para separar proteínas com base em seu tamanho e essas proteínas separadas são então transferidas para uma membrana. Esta técnica usa anticorpos primários específicos na marcação de uma proteína particular no blot. Os anticorpos secundários que são marcados com proteínas repórter detectam as proteínas marcadas com o anticorpo primário.

Principais áreas cobertas

1. O que é Western Blotting - Definição, fatos, aplicações 2. Como funciona o Western Blotting - Processo de Western Blotting

Termos-chave: Desenvolvimento de Cor, Membrana de Nitrocelulose, Anticorpo Primário, Anticorpo Secundário, Western Blotting

O que é Western Blotting

Western blotting é uma técnica de hibridização usada na detecção de uma determinada proteína em uma amostra. É também chamado de immunoblotting, pois a técnica usa anticorpos para marcar a proteína de interesse e detectar as proteínas marcadas com anticorpos.

Figura 1: Western Blot

O Western blotting foi desenvolvido pela primeira vez por Towbin em 1979 e atualmente é usado como uma técnica de rotina de análise de proteínas.

Como funciona o Western Blotting

O Western blotting é usado principalmente na detecção de uma proteína específica em uma amostra. As etapas da técnica de Western blotting são descritas a seguir.

1. SDS-PAGE - A amostra de proteína é separada com base em seu tamanho por SDS-PAGE.
2. Transferência de proteínas para uma membrana - As proteínas fracionadas por tamanho são transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou de difluoreto de polivinilideno (PVDF). As técnicas envolvidas nesta transferência são a transferência por difusão.
3. Bloqueio de sites não específicos - Os locais desocupados na membrana são bloqueados para evitar a ligação não específica de proteínas. Leite em pó desnatado ou albumina de soro bovino (BSA) podem ser usados ​​para essa finalidade.
4. Incubação de anticorpo primário - A membrana bloqueada é incubada com uma solução de anticorpo primário. Esses anticorpos primários se ligam a uma proteína específica na membrana.
5. Incubação de anticorpo secundário - A membrana é incubada com anticorpos secundários, que se ligam aos anticorpos primários. Os anticorpos secundários são conjugados com proteínas repórter. Estas proteínas repórter podem ser biotina, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano.
6. Detecção de proteína por desenvolvimento de cor - Os repórteres enzimáticos conjugados reagem com seu substrato para gerar uma fosfatase alcalina colorida que converte o BCIP em um produto de cor azul, enquanto a peroxidase de rábano converte o luminol, emitindo luminescência.

Figura 2: Western Blotting - Procedimento

Conclusão

Western blotting é uma técnica de hibridização usada na detecção da presença de uma determinada proteína em uma amostra. Ele usa SDS-PAGE para separar proteínas com base em seu tamanho e ligação com anticorpos primários, que podem ser reconhecidos por anticorpos secundários durante o desenvolvimento da cor.

Referência:

1. "Western Blotting Fundamental Principle, How Western Blots Work." Boster, disponível aqui.

Cortesia de imagem:

1. “Imunoblot de ácido anti-lipóico” Por TimVickers - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. “Western Blotting” Por Cawang - Trabalho próprio, CC0) via Commons Wikimedia