o principal diferença entre fase reversa e cromatografia de interação hidrofóbica é que o a cromatografia de fase reversa (RPC) usa um meio mais hidrofóbico, o que leva a interações mais fortes, enquanto a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usa um meio menos hidrofóbico quando comparado ao meio na cromatografia de fase reversa.

A cromatografia de fase reversa e a cromatografia de interação hidrofóbica são duas técnicas cromatográficas que dependem das interações entre as superfícies hidrofóbicas de um meio de cromatografia e as manchas hidrofóbicas na superfície das biomoléculas.

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O que é cromatografia de fase reversa

A cromatografia de fase reversa (RPC) é uma técnica cromatográfica usada na purificação e análise de biomoléculas, como proteínas, peptídeos e oligonucleotídeos. Proporciona uma separação de alta resolução e é ideal para mapeamento de peptídeos e verificação de pureza. O RPC é mais frequentemente usado no polimento final de peptídeos e oligonucleotídeos.

Dois tipos principais de meio hidrofóbico podem ser usados ​​como fase estacionária: grânulos de sílica cobertos com cadeias de carbono ou polímeros hidrofóbicos nus. Uma coluna é empacotada com o meio hidrofóbico em uma forma de leito empacotado no qual a amostra é aplicada. Um agente de emparelhamento de íons, como ácido trifluoroacético (TFA), pode ser adicionado à fase móvel para aumentar a formação de interações hidrofóbicas. Um modificador orgânico como 5% de acetonitrila é usado no início e a eluição pode ser iniciada com o aumento da% de acetonitrila.

Figura 1: Teoria da cromatografia de fase reversa

Biomoléculas que são menos hidrofóbicas / mais polares irão eluir primeiro, enquanto as moléculas mais hidrofóbicas irão eluir mais tarde. RPC é a técnica cromatográfica com a resolução mais alta.

O que é cromatografia de interação hidrofóbica

A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) é a outra técnica utilizada na separação de biomoléculas com base na hidrofobicidade em condições moderadas. É uma técnica ideal para a purificação de proteínas quando as amostras têm que ser submetidas à precipitação de sulfato de amônio na concentração e limpeza inicial da amostra. O nível elevado de sal durante a precipitação do sulfato de amônio aumenta a interação entre os componentes hidrofóbicos.

Figura 2: Efeito da alta concentração de sal nas interações hidrofóbicas

O meio hidrofóbico de HIC consiste em uma matriz inerte de partículas esféricas revestidas com ligantes contendo grupos alquil ou aril. As interações hidrofóbicas ocorrem sob concentrações moderadamente altas de sal (tipicamente 1–2 M de sulfato de amônio ou 3 M de NaCl). O tampão de início garante a ligação de proteínas de interesse ao meio enquanto lava as impurezas. O tampão de eluição contém baixa concentração de sal, enfraquecendo a interação entre as proteínas e a fase estacionária.

Semelhanças entre cromatografia de fase reversa e cromatografia de interação hidrofóbica

Diferença entre cromatografia de fase reversa e cromatografia de interação hidrofóbica

Definição

A cromatografia de fase reversa (RPC) se refere à técnica de separação de mais alta resolução com base na hidrofobicidade das moléculas em uma mistura, enquanto a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) se refere a um tipo de técnica de separação com base na hidrofobicidade, mas opera sob condições relativamente suaves.

Hidrofobicidade

O RPC opera em condições mais hidrofóbicas, enquanto o HIC opera em condições hidrofóbicas relativamente suaves.

Interações

A cromatografia de fase reversa leva a interações mais fortes entre as moléculas e a fase estacionária que deve ser revertida durante a eluição por um modificador orgânico, enquanto o HIC leva a interações moderadamente altas entre a fase estacionária e as moléculas.

Meio Hidrofóbico

RPC usa esferas de sílica cobertas com cadeias de carbono ou polímeros hidrofóbicos nus, enquanto HIC usa uma matriz inerte de partículas esféricas revestidas com ligantes contendo grupos alquil ou aril.

Buffer inicial

O tampão de início em RPC usa ácido trifluoroacético (TFA), enquanto o tampão de início de HIC usa concentrações de sal moderadamente altas.

Eluição

O aumento da porcentagem de acetonitrila inicia a eluição em RPC enquanto a diminuição da concentração de sal inicia a eluição em HIC.

Resolução

A cromatografia de fase reversa é a técnica cromatográfica com a maior resolução, enquanto a resolução de HIC é baixa quando comparada a RPC.

Formulários

O RPC é usado na separação de proteínas, peptídeos e oligonucleotídeos, enquanto o HIC é usado principalmente na purificação de proteínas.

Conclusão

A cromatografia de fase reversa é a técnica cromatográfica de maior resolução, que opera em condições altamente hidrofóbicas. Porém, o HIC opera sob condições hidrofóbicas moderadas. RPC e HIC são os dois tipos de técnicas de separação baseadas na hidrofobicidade. A principal diferença entre RPC e HIC é o grau de hidrofobicidade usado em cada técnica.

Referência:

1. Interação hidrofóbica e cromatografia de fase reversa: princípios e métodos. GE Healthcare, 2006. Disponível aqui

Cortesia de imagem:

1. “Reverse Phase Gradient Elution Schematic” Por Nategm - Trabalho próprio (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia 2. “Hicsalt” Por Daliak em Inglês Wikibooks - Transferido de en.wikibooks para Commons. (Domínio Público) via Commons Wikimedia