Principal diferença - Probe vs Primer

PCR é uma técnica usada em biotecnologia para amplificar fragmentos de DNA específicos para diversos fins. Sonda e iniciador são dois tipos de oligonucleotídeos de fita simples usados ​​em vários tipos de PCR. As sondas são usadas principalmente em qPCR, enquanto os primers sintéticos são usados ​​em todos os tipos de PCR. o principal diferença entre a sonda e o primer é que a sonda é aquela a sonda é usada para detectar a presença de um fragmento de DNA específico na mistura através da hibridização com um DNA de fita dupla, enquanto o primer é usado na iniciação da reação em cadeia da polimerase por hibridização com DNA de fita simples. Geralmente, os primers são usados ​​na iniciação da replicação do DNA dentro da célula. As sondas também são utilizadas em reações de hibridização.

Principais áreas cobertas

1. O que é uma sonda - Definição, Design, Importância 2. O que é um Primer - Definição, Design, Importância 3. Quais são as semelhanças entre a sonda e o primer - Esboço de características comuns 4. Qual é a diferença entre a sonda e o primer - Comparação das principais diferenças

Termos-chave: Hibridização, Oligonucleotídeos, PCR, Primer, Sonda, QPCR

O que é uma sonda

Sonda é um fragmento de DNA ou RNA usado para detectar a presença de um fragmento de DNA específico dentro de uma amostra. Portanto, as sondas podem ser usadas para dois tipos de técnicas, em qPCR e em reações de hibridização. Quatro fatos devem ser considerados no projeto de uma sonda.

1. Localização - As sondas devem hibridizar com a fita de DNA em estreita proximidade com o primer reverso ou direto. Mas, ele não deve se sobrepor aos locais de ligação do primer. Geralmente, as sondas hibridizam com qualquer uma das fitas do duplex de DNA.
2. Temperatura de fusão (Tm) - A temperatura de fusão da sonda deve ser 6-8 ° C mais alta do que a dos primers.
3. Temperatura de recozimento (Ta) - A temperatura de recozimento do experimento deve ser 5 ° C abaixo da temperatura de fusão dos primers.
4. Conteúdo GC - O conteúdo de GC da sonda deve ser 35-65%. A extremidade 5 ′ da sonda não deve conter um G.

Em qPCR, as sondas são marcadas com corantes fluorescentes ou elementos radioativos. Estas sondas são hibridizadas com a sequência alvo no duplex de DNA. Diferentes tipos de sondas marcadas, com elementos radioativos ou fluorescentes, também são usados ​​em vários tipos de reações de hibridização. A hibridização das sondas de PNA com suas sequências alvo são mostradas na figura 1. As sondas PNA são usadas para determinar o comprimento dos telômeros.

Figura 1: Hibridização de sondas PNA

Durante a hibridização, as sondas ligam-se ao DNA de fita simples de maneira complementar.

O que é uma cartilha

Primer refere-se a uma fita curta de DNA ou RNA que serve como ponto de partida da síntese de DNA. Os primers de RNA são usados ​​dentro da célula para iniciar a replicação do DNA com o auxílio da DNA polimerase. Os primers de DNA sintético são usados ​​principalmente em PCR para amplificar o fragmento de DNA desejado. A sequência alvo é flanqueada por dois primers conhecidos como primer direto e primer reverso. Especificidade e complementaridade são os principais fatores na concepção de primers. Estruturas secundárias também devem ser evitadas. Outros fatores que devem ser considerados durante o projeto de primers são descritos abaixo.

1. Temperatura de fusão (Tm) - A temperatura ideal de fusão do primer direto e reverso deve ser 60-64 ° C.
2. Temperatura de recozimento - A temperatura de recozimento do experimento deve ser 5 ° C abaixo da temperatura de fusão de cada primer.
3. Conteúdo GC - O conteúdo de GC dos primers deve ser de 35-65%.

O recozimento do primer direto e reverso para as duas fitas do DNA alvo é mostrado na figura 2.

Figura 2: Recozimento do Primer

No sequenciamento de DNA, os primers são usados ​​na amplificação do fragmento alvo. Os primers podem ser marcados com elementos radioativos ou fluorescência para vários fins de detecção.

Semelhanças entre a sonda e o primer

Diferença entre sonda e primer

Definição

Sondar: Sonda é um fragmento de DNA ou RNA usado para detectar a presença de um fragmento de DNA específico dentro de uma amostra.

Primer: Primer é uma fita curta de DNA ou RNA que serve como ponto de partida para a síntese de DNA.

Função

Sondar: As sondas são usadas para detectar um fragmento de DNA específico em qPCR.

Primer: Os primers são usados ​​para iniciar a replicação do DNA. Também é usado na iniciação da PCR.

Comprimento

Sondar: O comprimento de uma sonda pode variar de 25 a 1000 pares de bases.

Primer: O comprimento de um primer pode variar de 18-22 pares de bases.

Hibridização

Sondar: As sondas são hibridizadas com DNA de fita dupla.

Primer: Os primers são hibridizados com DNA de fita simples.

Marcação

Sondar: As sondas são geralmente marcadas com um fluoróforo para a detecção.

Primer: Os primers podem ser rotulados com base na finalidade.

Conclusão

Sonda e iniciador são dois tipos de oligonucleotídeos de fita simples usados ​​em vários tipos de PCR. As sondas são usadas na detecção de fragmentos de DNA específicos em qPCR. Os primers são usados ​​para iniciar a replicação do DNA dentro da célula e também são usados ​​na iniciação da PCR. Portanto, a principal diferença entre a sonda e o primer é sua finalidade.

Referência:

1. Projetando primers e sondas para PCR, Integrated DNA Technologies, disponível aqui.

Cortesia de imagem:

1. “Fluxo de trabalho do Q-FISH” Por Jclam na Wikipedia em inglês (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia2. “Primers RevComp Elongation” Por Richard Wheeler (Zephyris) - Trabalho do próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia